开学了，过了一个寒假，ELISA实验操作还记得吧，今天恒远生物就带大家一起来回顾下ELISA实验的疑难点！

    实验原理
    ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检

物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

    实验流程
    夹心法ELISA：

    1.加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔100 μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。

    2.生物素化抗体/抗原：弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中立即加入生物素化抗体/抗原工作液100 μL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃孵育1小时。

    3.洗涤：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350 μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。

    4.HRP酶结合物：每孔加酶结合物工作液100 μL，混匀，加上覆膜，37℃孵育30分钟。

    5.洗涤：弃去孔内液体，洗板5次，方法同步骤3。

    6.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混匀，加上覆膜，37℃避光孵育15分钟左右。提示：根据实际显色问题酌情缩短或延长孵育时间，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

    7.终止：每孔加终止液50 μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

    8.读值：立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热，设置好检测程序。

    9.实验完毕后，将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。

    竞争法ELISA：

    1.加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔50 μL。待测样品加入到其他孔，每孔50 μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。立即每孔加入配好的

生物素化抗体工作液50 μL。混匀，给酶标板覆膜，37℃孵育45分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。

    2.洗涤：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350 μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。

    3.HRP酶结合物：每孔加酶结合物工作液100 μL，混匀，加上覆膜，37℃孵育30分钟。

    4.洗涤：弃去孔内液体，洗板5次，方法同步骤2。

    5.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混匀，加上覆膜，37℃避光孵育15分钟左右。提示：根据实际显色酌情缩短或延长孵育时间，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

    6.终止：每孔加终止液50 μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

    7.读值：立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热，设置好检测程序。

    8.实验完毕后，将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。

    恒远生物十几年来一直致力于生物科研领域，提供全面的、创新的、优质的、便捷的科研产品和服务。目前，其自主研发的重组蛋白、抗体、ELISA检测试剂盒得到广大科研用户的认可，并且多次发表于期刊，进一步推动了民族品牌化的传播。