ELISA（酶联免疫吸附试验）预实验是开展正式实验前不可少的环节，主要用于摸索合适的实验条件及确定实验的可行性。以下是ELISA预实验的开展过程，一起来看看吧！

一、预实验的目的

确定实验条件：如抗原或抗体的浓度、酶的种类和浓度、洗涤液的浓度和pH值等，以确保实验的准确性和可靠性。

确定实验范围：包括最佳反应时间和浓度范围，以确保在正式实验中获得最佳的实验结果。

验证实验方法：确保实验方法的准确性和可靠性。

减少实验误差：提高实验的重复性和可重复性。

二、预实验的方法

1.实验样本的选择：

预实验一般通过测定少数有代表性的样本来确定正式实验方案。通常，测定的样本会分为不同的组别，不同组别的样本由于前期处理或刺激后，靶标物的表达量会产生变化。建议从各组样本中随机选择1~2例样本。如果正式实验测定的样本数量多，分配到预实验的试剂量有限，那么至少选择两例样品，建议选用1例为理论上靶标物含量zui低组的样品，另1例为理论上靶标物含量最高组的样品。

2.最适稀释倍数的确定：

①将样本梯度稀释，可根据样本中靶标物的浓度，选择2倍、5倍或10倍梯度稀释，同时测定标准品。

②标准品的制备需按照试剂盒说明书的要求，试剂量充足可以选择一条完整的标曲，试剂量有限也可以选择部分浓度点（如空白孔、zui低浓度孔、中间浓度孔以及最高浓度孔）。

③将测定的不同稀释浓度的样本测定的OD值（光密度值）与梯度浓度标准品OD值进行对比，最佳稀释倍数为此倍数稀释后全部或绝大多数样本OD值能够位于标准曲线中间浓度孔对应的OD值，即标准曲线的最佳拟合区域。

④在做预实验时，一定要设置标曲，不设置标曲则无法通过比较确定最适稀释倍数。

3.抗原包被浓度的设定：

①将抗原溶液分别按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的浓度稀释在抗原包被液中。

②以等量随机选取的特异性抗体血清与抗原溶液反应，在37℃孵育1小时后清洗，然后加酶标二抗，孵育30分钟清洗，zui hou加底物显色，反应终止后用酶标仪在450nm波长下测定各孔的光密度值。

③绘制ROC曲线（受试者工作特征曲线），找出临界值。

4.酶标二抗稀释比例的确定：

①取已知阳性和阴性血清样本，分别用ELISA稀释液将特异性抗体稀释成不同浓度的酶标二抗溶液，与包被抗原孵育、清洗后加底物显色，zui hou用酶标仪测定光密度值。

②绘制ROC曲线，找出临界值。

5.显色时间的确定：

①显色是ELISA实验中zui hou一步温育反应，固定在酶标板上的酶催化无色底物生成有色产物。

②由于ELISA实验会受到环境差异及实验操作差异的影响，商业化的ELISA试剂盒通常不会推荐固定的显色时间，而是建议实验操作人员根据显色情况判断合适的显色反应时间。

③加入底物后可定时观察反应孔的颜色变化（如每隔5分钟观察一次），当标准孔的前3~4孔有明显的梯度蓝色，后3~4孔梯度不明显时，即可终止。通过预实验熟悉操作的同时，也能确定合适的显色时间。

三、注意事项

①在进行预实验时，应严格按照ELISA试剂盒的说明书进行操作，避免由于操作不当导致的实验误差。

②预实验的结果应认真记录和分析，以便为正式实验提供可靠的依据。

③在预实验过程中，如发现任何异常或不符合预期的结果，应及时查找原因并进行调整。

通过以上预实验的设置和操作，可以对ELISA实验的条件进行初步的摸索和优化，为后续的正式实验提供可靠的基础。同时，也能及时发现实验中存在的问题，进行针对性的改进，提高实验的准确性和可靠性。上海恒远生物专业提供生命科学领域的技术服务，提供实验技术服务，为广大科研工作者大大节省了重复劳动的时间和精力，我们有过硬的技术咨询和完善的售后服务，购买ELISA试剂盒赠送免费代测服务，在线一对一技术指导，为您解决后顾之忧。