1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。

3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。

3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。

4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。

5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。

6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。

7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。

8．混合：NGS（100微升），印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）

9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。

10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。

11．按步骤9洗涤。

12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。

注意事项：

western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。

1.蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）

1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，小心取出带有凝胶的玻板，用割胶刀沿下边缘小心撬开短板，按样品的多少切下合适大小的凝胶。浸泡在转膜缓冲液中5分钟左右，以平衡离子强度。视情况决定是否切角标记。

2）电泳结束前，应泡好3M滤纸2-6张均可（普通滤纸也可）和1张硝酸纤维素滤膜。

3）戴上手套按如下顺序安装转移装置：

      a.平放底部电极（阴极），放一张海绵垫片。

      b.在海绵垫片上放置1-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。

      c.取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。排除所有气泡。

      d.把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。 

     e. 把zui后1-3张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方，同样须确保不留气泡。其实，用玻棒给点压力很容易排除气泡。

      f.放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板，夹紧。保证对凝胶有一定的压力。

4）连接电源。

      我做90KD的蛋白，电转移100分钟，电压100v。电转过程中，尽量给个低温环境，我放在冰水里转膜，也用内置的冰盒或者是放在4-8摄氏度的层析柜中。

5）断开电源，拆卸转移装置，逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，可检查蛋白质转移是否*。要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色3-10分钟，然后蒸馏水冲洗

6）切去滤膜的左下角，以标记，如有预染MARKER也可不标。

7）杂交与显色： ① 封闭 ② 一抗孵育：分别与相应的抗体及内参照抗体孵育 ③ 漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上，每次各10min。 ④ 与二抗孵育：与辣根过化物酶标记的二抗孵育 ⑤ 漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗4次以上，每次各10min。 ⑥ ECL显像；⑦ 显影定影完毕.