实验原理：

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代先进的细胞定量分析技术。FCM所有这些功能的实现依赖于一种特殊的仪器——流式细胞仪，它是综合了激光、电脑、流体力学、光学和荧光细胞学等先进技术的高科技产品。流式细胞主要是测量单个细胞经适当染色后所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光／荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。流式细胞术不仅可测量细胞的大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，在细胞生物学、血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

材料与仪器：

培养的细胞 外周血单个核细胞

小牛血清 无水乙醇 RNase A PBS PI Heochst 33342染液。

流式细胞仪 玻璃管、塑料管 离心机 荧光显微镜 400目的筛网

操作步骤：

一、单细胞悬液制备方法

流式细胞术的分析检测建立在单个细胞的基础上，制备合格的单个分散的细胞悬液是非常关键的一环。对不同来源和不同形式的样品，根据各种样品的特点可选择不同的分散方法。

1. 单层培养细胞、血液、各种脱落细胞等样品，标本经过简单的制备悬液，离心分离处理，就可以得到分散较好的单个细胞悬液，是理想的流式细胞术检测对象。

2. 对于不同组织来源的实体组织标本，采用酶消化法、机械法和化学试剂处理法来分散细胞。

3. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备，可使大量存档的临床资料重新得到研究与利用，从而扩大了流式细胞术的应用范围。样品制备一般通过切片、脱脂、水化、消化及终止消化后过滤再收集细胞悬液，去除碎片的单细胞悬液用70％乙醇固定保存。

二、检测细胞周期各时相的细胞百分数

1. 培养或分离的细胞约为1×106，离心沉淀后用0.3ml含10％小牛血清的PBS悬浮，移入1.5ml EP管中，加入0.7ml无水乙醇，置-20℃下固定24h以上。

2. 3000 r/min离心30s，弃上清液，用lml PBS重悬细胞，再离心洗涤细胞一次。

3. 弃上清液，沉淀细胞用100μl 1mg/ml RNase A悬浮，37℃下放置30min。

4. 加入400μl 50μg/ml PI，置暗处10min。

5. 最后用流式细胞仪测定。

根据流式报告中给出G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比、凋亡百分比和细胞倍体进行实验分析。

三、流式细胞仪检测细胞凋亡（Heochst 33342/PI双染色法）

1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342，终浓度为l μg/ml；37℃培养箱孵育7——10min。

2. 500——1000 r/min低温离心5min，弃去染液。

3. 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

4. 400目的筛网过滤1次。

5. 流式细胞仪检测分析。

四、结果观察

1. 根据流式报告中给出的G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比、凋亡细胞百分比和细胞倍体进行实验分析。

2. 细胞凋亡观察

Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400——500nm，产生蓝色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波长为488nm，发射光波长大于630nm，产生红色荧光。分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。

3. 结果判断

在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光。