Western 免疫印迹具体操作说明书

上海恒远生物代做 Western 免疫印迹实验操作，咨询关于实验的有关事项，感谢您对上海恒远生物的支持与信赖，祝您实验成功。

实验试剂

1. SDS-PAGE试剂:见电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H2O2 1.0μl。

实验步骤

1. 蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：（半干式转移）

   (1) 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

   (2) 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

   (3) 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
4. 免疫反应：

   (1) 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

   (2) 加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

   (3) 弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

   (4) 加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

   (5) 弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。

   (6) 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。
   (7) 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

   (8) 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

注意事项

1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定*条件。
2. 显色液必须新鲜配置使用，zui后加入H2O2。
3. DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。