上海恒远生物提供猪胰蛋白酶制备方法，欢迎阅读参考

（一）猪胰蛋白酶原的提取

• 猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。
• 加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱

布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。

• 加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过

夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。（二）胰蛋白酶原激活

• 向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶

解，得胰蛋白酶原溶液。将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使 Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中zui终仍含有0.1M CaCl2。

2．用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。

3．活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。

（三）胰蛋白酶的分离

1．将已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。

2．滤液按250克/升加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。

（四）胰蛋白酶的结晶

1．将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。

2．用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。3．放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。

4．放置2～5天可得到大量胰蛋白酶结晶，待结晶析出*时，抽滤，母液回收。

（五）胰蛋白酶的重结晶

将*次结晶的胰蛋白酶产物进行重结晶：用约1倍的0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约1.0～1.5倍体积的pH9.0 的0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2M NaOH调溶液pH至8.0（准确）（体积过大，很难结晶），冰箱放置1～2天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。

注意事项

（1）胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致实验失败。

（2）在室温14～20℃条件下8～12小时可激活*，激活时间过长，因酶本身自溶而会使比活降低，比活性达到 “3000～4000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活。

（3）要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗心大意，前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。酶蛋白溶液过稀难形成结晶，过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处，一般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。

（4）过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制PH。

（5）*次结晶时，3～5天后仍然无结晶，应检查pH，必要时调整pH或接种，促使结晶形成。重结晶时间要短些。