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细胞活性测定方法
时间：2011/8/29      阅读：7526

　　　　　　　　细胞活性测定方法

细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、 MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很 多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。
现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：
1.MTT法
MTT：化学名： 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱 氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的 甲 ，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛 用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲 产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲 的有机溶剂对 实验者也有损害。
2.XTT法
XTT：化学名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲 产物。当XTT与电子偶合剂（例如 PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲 产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。
缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。
3.CCK-8法或称WST-8法
CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐]，它 在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物 （Formazan）。生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被 广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于 MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
缺点:1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多 加。
三种方法的比较
 
MTT法
XTT法
CCK-8法（WST-8法）
甲臜物水溶性
难溶性
水溶性
水溶性
检测波长
490 nm
450nm
450nm
性状
粉末
2瓶溶液
1瓶溶液
使用方法
配成溶液后使用
现配现用
毋需预制
使用有机溶剂
DMSO或其它溶剂
—
—
方便性
+
++
+++
检测速度
+
++
+++
重复性
+
++
++
稳定性
++
+
++
工作量
---
--
-
对细胞毒性
---
--
-
对人体毒性
---
-
-
 
 
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项
MTT原理
MTT全称为3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
　　缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法
     通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
     需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度在0-0.7范围内。
MTT一般现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心，有条件带那种透明的簿膜手套。配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl 8g ＋ KCl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g调pH 7.4，定容1L。
普通MTT法实验步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
2：培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul。继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤
贴壁细胞：
1：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2：5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反应真实情况
3：5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5：终止培养，小心吸去孔内培养液。
6：每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7：同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
悬浮细胞：
1：收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释（储存液100mg/ml，需预试寻找*稀释度，1:10-1:20）；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）
2：置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3：每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
注意事项：
（1） 选择适当得细胞接种浓度。
（2） 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3） 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，zui后比色以空白调零。
（4） MTT实验吸光度zui后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
（5） 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。
（6） 一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲臜洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
 
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