瞬时转染到293 T细胞

目的

瞬时转染到293 T细胞是一种方便的方式过度和两个细胞和细胞外（分泌或膜）蛋白。293是人类肾上皮细胞，腺病毒转化基因产品。293 T是导数也表达SV4 0大T抗原，使游离复制质粒含有SV4 0的起源和早期启动子区域。他们（两个）有不寻常的财产被高度transfectable由以下磷酸钙（磷酸）2transfection协议。高达50%的效率是可以实现的。

材料

•*培养液（高血糖）：补充瓦特/ 10%总线（无论是瓦特/或瓦特/热灭活在55°℃/分钟），非必需氨基酸，na-pyruvate，和谷氨酰胺（笔/ streptmycin：可选）

•转染试剂：

我）200 CaCl 2：2米水，过滤消毒，储存在4摄氏°

二）x2hbs：8.0克氯化钠，氯化钾0.37g，201mg（是的！毫克）2HPO 4•无水，用葡萄糖，5克/毫升培养基（调整PH值7.05氢氧化钠和过滤消毒，储存在4摄氏°）

•脱氧核糖核酸试剂盒提取成绩好。溶液中电子兼容。基本上，没有必要将脱氧核糖核酸。

程序

培养条件

增长将很快。通常倍增时间< 1天的观察。分裂细胞4天，每3 ~ 10至1 : 20稀释和文化下5%的二氧化碳。细胞松散连接，所以你可以分离细胞与ED TA单独但短暂的胰蛋白酶消化为单悬。不overtreat胰蛋白酶。

转染293细胞

以下的协议是10厘米的菜（中：10毫升）。如果你使用6孔或12孔板，总体积的介质应3毫升和一点五毫升，分别，和数额减少每个试剂因此。

1。细胞的前一天晚上给60 - 70 %融合在一天的转染。如果达到100%的效率也会降低总汇。小于50%融合可能确定但数额蛋白表达会很低，因为少量的细胞。

2。一小时前的转染，改中含有25µ米氯喹（从中国股票在公共电视网，储存在- 20摄氏°）。量应该是10毫升每碟。（氯喹可以省略，但效率提高约10）

3。添加10µ克基因ddh2o（1095µ我总）在15毫升无菌试管，然后添加155µ我200氯化钙。当你准备好后，加入1250µ升2xhbs滴轻轻搅拌。添加此混合物直接向细胞滴通过介质。做在1 - 2分钟后加入2xhbs。你会发现中变成橙色。确保你均匀洒滴在整个地区。

4。培养7 - 11小时很细，可见粉尘状沉淀。孵化后，冲洗一次，变化中又无氯喹，10 ml /碟。

5。收获细胞，或培养上清液中，转染后48至72小时。分泌蛋白，可以改变你的媒体（3天或4，节省收集增刊）并给它一个3 - 4天的文化。只要细胞还活着，他们生产的蛋白质。然而，当时的分泌水平达到zui大值之间的差异蛋白质。